Artikkelen foreslår en ny mikrofluidisk brikk -teknologi for multiplexdeteksjon av reke patogene mikroorganismer. Forskerteamet integrerte multi-enzym isotermisk hurtig nukleinsyreforsterkning (MIRA) teknologi og sanntids fluorescensdeteksjonsmetoder. Denne mikrofluidiske brikken gir en rask, følsom og effektiv løsning for påvisning på stedet av store rekepatogener.
Forskningsbakgrunn og betydning
Den globale rekeoppdrettsnæringen er en av de viktigste økonomiske komponentene innen havbruk, men industrien har lenge møtt trusler fra en rekke patogene mikroorganismer. Disse patogenene fører ofte til storstilt død av reker, og påvirker alvorlig produksjon og økonomiske fordeler. Inkludert akutt hepatopancreatic nekrose sykdom (AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), smittsom hypodermal og hematopoietisk nekrose virus (IHHNV), Reker for hemocyten.
Tradisjonelle patogendeteksjonsmetoder, så som polymerasekjedereaksjon (PCR -teknologi), har høy følsomhet og spesifisitet, men er kompliserte å operere, ta lang tid og stole på laboratorieutstyr. Disse begrensningene gjør PCR-teknologi uegnet for rask testing på stedet. MIRA-teknologi har blitt et molekylært deteksjonsverktøy som er egnet for applikasjon på stedet på grunn av dens raske forsterkningsegenskaper under konstant temperatur og normal temperatur.
MIRA -teknologiprinsipp
Multi-enzym konstant temperatur Rask nukleinsyreforsterkningsteknologi (MIRA-teknologi) er en forsterkningsteknologi med konstant temperatur som er avhengig av synergien til flere funksjonelle proteiner ved romtemperatur for å oppnå rask amplifisering av nukleinsyrer. Det er en virkelig bærbar hurtig nukleinsyredeteksjonsteknologi på stedet. Sammenlignet med PCR har Mira flere fordeler.
Design og innovasjon av mikrofluidiske brikker
Skjematisk diagram over RPA -deteksjonsplattform på ChIP for flere viktige rekepatogene mikroorganismer
(A) Struktur av en mikrofluidisk brikke av skivetype. 1: Reaksjonskammer; 2: kuleventil; 3: Eksosport; 4: Prøvetakingsport;
(B) Eksplodert utsikt. 5: Varmeforseglingsfilm; 6: ChIP -underlag.
(C) Detaljert utforming av de seks settene med primere i sektoren. Hvert primersett er forhåndsfiksert i et utpekt reaksjonskammer.
(D) Fullstendig driftsprosedyre på RPA-deteksjonsplattform på brikken.
Artikkelen foreslår en mikrofluidisk brikke integrert med MIRA -teknologi for multiplexdeteksjon av reke patogene mikroorganismer. Mikrofluidisk teknologi kan kontrollere væsker i mikronnivåkanaler for presis manipulering, og dermed oppnå effektiv og lavpris multi-måldeteksjon.
Brikken har følgende nøkkeldesignfunksjoner:
● Sentrifugal mikrofluidisk brikke
Brikken vedtar en sentrifugalt drivdesign ved bruk av sentrifugalkraft for å fordele prøven jevnt inn i hvert reaksjonskammer. Denne designen forenkler driftsprosessen, og operatøren kan fullføre hele reaksjonen ved å bare injisere prøven.
● Deteksjon av flere mål
CHIP er forhåndsinnstilt med bakterietypene som må oppdages: akutt hepatopancreatic nekrose (V-AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious SubcutuTe necrose. ) Primerprober for fem patogener. Denne utformingen kan samtidig oppdage seks genmål i en reaksjon, noe som muliggjør rask screening av flere patogener.
● Real-time fluorescensdeteksjon
MIRA -teknologiforsterkningsreaksjonen i brikken er kombinert med en lysstoffrør, som kan overvåke fremdriften for amplifiseringsreaksjonen i sanntid. Probe -utformingen gjør det mulig å frigjøres fluorescerende signal bare når amplifiseringsproduktet genereres, og dermed oppnå rask og sensitiv kvantitativ deteksjon.
● Lavkonsentrasjonsreaksjonssystem
Hver reaksjonsenhet av brikken krever bare et reaksjonsvolum på 5 ul, noe som reduserer reagensforbruket kraftig. Når hele systemet kjører, kan opptil fire prøver behandles samtidig, og hver prøve kan oppdage fem patogener, noe som forbedrer deteksjonseffektiviteten kraftig.
Følsomhet, spesifisitet og repeterbarhet
Ytelsen til brikkesystemet inkluderer deteksjon av symmetri, resonans og repeterbarhet.
● Følsomhet
Eksperimentelle resultater viser at brikken kan oppdage målgen -kopienummer så lave som 10 kopier/μL, med følsomhet som er sammenlignbare eller til og med høyere enn tradisjonelle PCR -metoder. Denne høye følsomheten sikrer at teknologien kan oppdage tidlig infiserte individer i praktiske anvendelser, og dermed muliggjøre tidlig screening av patogener.
● Spesifisitet
Eksperimentet utførte tverrreaksjonstester på en rekke patogener som ikke er mål, og resultatene viste at brikken er svært spesifikk for målpatogenene og nøyaktig kan skille forskjellige typer patogener. Alle tester for akutt nekrose-sykdom (V-AHPND), White Spot syndrom-virus (WSSV), smittsom hypodermal og hematopoietisk nekrose virus (IHHNV), indisk hemacytic iRrus (IHHN-REPATICATICATICATIONS HEPIDATICATIONS HEPIDATICATIONS HEPIDATICATICATION, INNHHN), indicaty hemacy Irrus (IHHN), indicates hemacy hematopoietic necrose Virus (IHHN), indisk hemacy hemato Metode kan effektivt unngå uspesifikk forsterkning.
● Repeterbarhet
For å evaluere stabiliteten til metoden gjennomførte forskerteamet flere gjentatte eksperimenter. Resultatene viste at variasjonskoeffisienten (CV -verdien) mellom forskjellige eksperimenter var mindre enn 10%, noe som viste god eksperimentell repeterbarhet og konsistens.
Feltapplikasjoner og fordeler
Utformingen av MIRA -teknologien mikrofluidisk brikke gir den betydelige fordeler for feltapplikasjon, spesielt egnet for rask påvisning og overvåking av patogener i rekeoppdrett:
● Praktisk driftsprosess
Hele deteksjonsprosessen krever bare å injisere prøven i brikken og starte reaksjonsenheten. Det krever nesten ingen manuell drift og er egnet for ikke-profesjonelle å bruke på stedet.
● Rask responsevne
Systemet kan oppnå testresultater innen 20 minutter, og forkorte testtiden i stor grad. Dette er avgjørende for rask sykdomsrespons i gårder og reduserer spredningen av patogener.
● Multiplex deteksjonsevne
Fem hovedpatogener kan identifiseres i en test, noe som forbedrer deteksjonseffektiviteten og sparer deteksjonskostnader og tid.
MIRA -teknologiutsikter
Selv om PCR -teknologi lenge har blitt vurdert som gullstandard for nukleinsyreforsterkningsdeteksjon, har MIRA -teknologi vist stort anvendelsespotensial på grunn av dets raske reaksjon ved konstant temperatur, enkel drift og krav til lavt utstyr. Ved å sammenligne med PCR kombinert med DNA -sekvensering, ble det funnet at deteksjonsresultatene fra den isotermiske amplifiseringsbrikken stemmer overens med PCR -resultatene når det gjelder følsomhet og spesifisitet, og reaksjonstiden for MIRA -teknologi er betydelig forkortet. Derfor anses MIRA-teknologi-mikrofluidiske brikker for å være en teknologi som er mer egnet for feltapplikasjoner, spesielt i miljøer som krever rask og storskala patogendeteksjon.
Mikrofluidiske flis basert på isotermisk hurtig nukleinsyreforsterkning (MIRA) teknologi gir et effektivt verktøy for påvisning av patogene mikroorganismer i rekeoppdrett. Denne teknologien har fordelene med høy følsomhet, god spesifisitet, enkel drift og rask deteksjonshastighet, og har brede anvendelsesutsikter innen forebygging og kontroll og kontroll av akvakultur. Med videre utvikling og optimalisering av teknologien forventes systemet å bli brukt på påvisning av mer vannlevende patogener, noe som muliggjør bredere sykdomsforebygging og overvåking.
Forskningsresultatene gir en pålitelig tidlig deteksjonsmetode for akvakulturindustrien, som effektivt kan redusere risikoen for sykdomsutbrudd, forbedre produksjonseffektiviteten og produksjonen av gårder, og legge et teknisk grunnlag for bærekraftig utvikling av akvakulturindustrien.