《Etablering av en mikropterus salmoides rhabdovirus deteksjonsmetode basert på CRISPR Cas13a System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing Etablering av en deteksjonsmetode. Chinese Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides, også kjent som California Bass eller American Black Bass, er en ferskvannsfisk hjemmehørende i Nord -Amerika. De siste årene har det blitt en viktig oppdrettsfisk over hele verden på grunn av etterspørselen med høy marked: Micropterus Salmoides har fast kjøtt, få bein, deilig smak, rik ernæring, spesielt høyt protein og lite fett, som dekker forbrukernes etterspørsel etter sunn mat. Derfor er markedsprisen relativt høy, og den brukes ofte i high-end cateringmarkedet. Rask vekst: Micropterus Salmoides vokser raskt og kan generelt nå varespesifikasjoner i 6-8 måneder. Det er egnet for avl av kort syklus og kan raskt realisere investeringsavkastning. Sterk sykdomsresistens: Sammenlignet med annen oppdrettsfisk, har Micropterus Salmoides sterk tilpasningsevne til miljøet, mindre storskala sykdomsutbrudd og reduserer avlsrisiko. Økologisk avl: Largemouth -bass kan blandes med annen ferskvannsfisk som sølvkarpe og gresskarpe, noe som hjelper til med å oppnå dam økologisk balanse og maksimere ressursutnyttelsen, forbedre avlseffektiviteten og andre faktorer. Det blir ønsket velkommen av spisesteder og akvakulturbønder, og avlskalaen har vokst raskt de siste årene.
Selv om Micropterus Salmoides er relativt sykdomsresistente, kan de fremdeles lide av noen sykdommer under dårlige avlsforhold. Blant dem er Micropterus Salmoides rhabdovirus (MSRV) ekstremt skadelig: det ble først oppdaget i Florida, USA i 1991. Viruset ble opprinnelig påvist i vill largemouth basspopulasjoner, og deretter gradvis spredte seg til mange ferskvannsinnsjøer og reservoarer i USA, ble en av hovedpoogen av store store store som store store store og ene.
Kliniske symptomer på syke fisk
A: sunn largemouth -bass, pilen indikerer eggeplommen; B: Syke largemouth -bass, pilen indikerer eggeplomme.
Overføringskilden er ofte infisert yngel eller voksen fisk, forurensede vannforekomster og villfisk som bærer viruset; Dette viruset kan overføres gjennom direkte kontakt, fekal utskillelse og vannforekomster, og det er mer sannsynlig å oppstå under dårlig vannkvalitet eller avlsforhold med høy tetthet. diffusjon. Viruset kan forårsake slapphet, vandring, hevelse i magen og kroppsforvrengning i ung fisk, samt indusere nekrotiske magesår og multi-organ-blødning. Når den er infisert, overstiger dødeligheten 90%.
Kliniske symptomer på kunstig infiserte Micropterus Salmoides
A: sunn largemouth bass; B, C, D: Kunstig infisert largemouth bass.
Hvert år går mer enn 30% av Micropterus Salmoides yngel tapt på grunn av MSRV. Foreløpig er behandlings- og deteksjonsmetodene for viruset fremdeles umodne, og det er ingen spesifikk medisin som behandler det. Derfor er det veldig nødvendig å oppdage viruset i tid før infeksjon og ta effektive forebyggende tiltak, noe som kan redusere tapene i avlsprosessen til en viss grad;
I tillegg er det vanskelig å utføre deteksjon på stedet uten komplekst deteksjonsutstyr med eksisterende deteksjonsteknologi. I møte med denne utfordringen har forskerteamet ved South China Agricultural University utviklet en ny deteksjonsmetode som kombinerer MIRA med CRISPR-System. Denne metoden har sterk spesifisitet, høy følsomhet og enkel drift, noe som forbedrer deteksjonseffektiviteten til MSRV i stor grad og også hjelper til med å oppdage MSRV så tidlig som mulig og ta forebygging og kontrolltiltak.
Mira Primer Combination Screening
To par av forskjellige MIRA -primere ble brukt for å forsterke genfragmentet som inneholdt målsekvensen, og de amplifiserte produktene ble utsatt for agarosegelelektroforese. Elektroforesegrafen var lokalisert i posisjonen til 100 bp, og lyse bånd dukket opp i alle tre baner, noe som indikerte at det var ikke-spesifikke amplifiseringsprodukter. De amplifiserte målbåndene ved 250 bp i baner 2 og 3 ble henholdsvis kvantitativt analysert ved bilde J -programvare, og resultatene fra den kvantitative analysen ble uttrykt med "grå verdi". Fra analyseresultatene kan det konkluderes med at jo lavere den grå verdien, jo høyere primerutnyttelsesgrad, det vil si, jo høyere primerspesifikke bindingsforsterkningseffektivitet.
Resultatene viste at den spesifikke bindingsforsterkningseffektiviteten var høy når MIRA-F2/R2-primerparet ble brukt.
Mira Primer Pair Screening Electrophoresis Gel Image and Grey Value Analyse
en. Electrophoresis Lane M: 2000 bp DNA -markør; Elektroforesefelt 1. Negativ DNA -prøveforsterkning; Elektroforesefelt 2. Mira-F1/R1 primerpar forsterker målfragmentet (224 bp som vist i boksen); elektroforesefelt 3. Mira-F2/R2 primerpar forsterker målfragmentet (255 bp som vist i boksen); b. Band Gray Value Analyse (som vist i boksen)
CRISPR/CAS13A Deteksjonssystem
Etter at reaksjonen fra CRISPR/CAS13A deteksjonssystem er fullført, bestråles det med ultrafiolett lys for å observere resultatene.
CRISPR/CAS13A Deteksjonssystem-fluorescens Lysstyrke diagram
1-3. Hele systemet med RNA -standard lagt til; 4. Ingen crRNA lagt til; 5. Ingen Cas13A -protein tilsatt; 6. Ingen ssRNA -reporter -sonde lagt til; 7. Negativ kontroll
CRISPR/CAS13A-MSRV Optimalt reaksjonssystem
Vi gjennomførte eksperimenter ved bruk av RNA -standarder og amplifisert prøve RNA. Posisjonshastigheten til mål -RNA var bedre med crRNA2 enn med crRNA1. CrRNA1 hadde et sterkere sluttfluorescenssignal enn crRNA2. Den blandede bruken av crRNA 1+ crRNA2 i like proporsjoner kan kombinere fordelene ved begge og oppnå bedre reaksjonseffektivitet.
Optimalisering
en. Sammenligning av deteksjonsresultater av standard RNA ved bruk av crRNA med forskjellige avstandssekvenser;
b. Sammenligning av fluorescenssignaldata for standard RNA påvist av deteksjonssystemet ved forskjellige temperaturer;
c. Sammenligning av fluorescenssignaldata for standard RNA påvist ved bruk av RNA -reporterprober med forskjellige konsentrasjoner;
d. Sammenligning av deteksjonsresultater av standard RNA påvist ved bruk av cas13a/crRNA -sondekomplekser med forskjellige konsentrasjonsforhold;
For å utforske effekten av reaksjonstemperatur på deteksjonssystemet ble det satt forskjellige reaksjonstemperaturer på 31 grader, 34 grader, 37 grader og 41 grader. Den optimale reaksjonstemperaturen til CRISPR/CAS13A-MSRV Deteksjonssystem var 37 grader.
For å utforske effekten av ssRNA -reporter -sondekonsentrasjon på deteksjonssystemet, innenfor testområdet, var fluorescensintensiteten positivt korrelert med ssRNA -reporter -sondekonsentrasjonen. Deteksjonseffekten av ssRNA -reporter -sondekonsentrasjon var ikke mye forskjellig ved 500-700 nmol/l. Tatt i betraktning de faktiske økonomiske problemene, var den optimale ssRNA -reportersondekonsentrasjonen 500 nmol/l.
For å utforske effekten av forskjellige Cas13A- og crRNA -reaksjonskonsentrasjonsforhold på deteksjonssystemet, når forholdet mellom cas13a: crRNA var 4: 1 og 3: 1 basert på forholdet på 100 nmol/l per del, nådde Cas13a metning; Når mengden CAS13A var konstant, var ikke intensiteten til fluorescenssignalet positivt korrelert med økningen i mengden crRNA. Derfor, når forholdet mellom cas13a og crRNA er 2: 1, kan CRISPR/Cas13a-MSRV deteksjonssystem oppnå maksimal deteksjonsaktivitet.
Følsomhetsevaluering
For å utforske minimumsdeteksjonskonsentrasjonen av MSRV av CRISPR/CAS13A-MSRV Deteksjonssystem, ble RNA-standarden fortynnet 10 ganger i en serie og oppdaget av CRISPR/Cas13A-MSRV Deteksjonssystem. CRISPR/CAS13A-MSRV Deteksjonssystem kan oppdage minst 100FM MSRV-mål-RNA. Når mål -RNA -konsentrasjonen er lavere enn 100FM, er fluorescenssignalet som er påvist av maskinen ikke vesentlig forskjellig fra den blanke kontrollen. Derfor kan CRISPR/CAS13A-MSRV deteksjonssystem oppdage minst 100FM MSRV ssRNA.
Evaluering av spesifisiteten til CRISPR/CAS13A-MSRV Deteksjonssystem for MSRV
Eksempelstesting
For syke fiskeprøver med åpenbare tegn på sykdom samlet inn fra sjøbassgårder, bekreftet vi om patogenet som ble smittet av den syke fisken var MSRV. Vi brukte primere som er spesifikke for MSRV -kapsidproteinsekvens for PCR -amplifisering, og sendte de tilsvarende båndene i elektroforesediagrammet for testing. Etter sammenligning bekreftet vi at det var MSRV.
Bekreftelse av MSRV -sekvensinformasjon
en. PCR -amplifisering av 228 bp produktbånd av MSRV -primere; b. MSRV kapsidproteinsekvens
De syke fiskeprøvene infisert med MSRV ble forbehandlet og forforsterket for viralt RNA, og deretter testet med den negative kontrollgruppen. Samtidig ble cDNA av prøvene ekstrahert for sammenligning med konvensjonell qPCR. De positive prøvene (nr. 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 og 15) påvist av CRISPR/Cas13a-MSRV deteksjonssystem var de samme som resultatene av konvensjonell qPCR, hvor CQ-verdien av qPCR var mellom 18 og 25; Mens terskelsyklus antall negative prøver (nr. 1, 2, 4, 5, 9, 10 og 11) var større enn 38, noe som indikerte at prøvene ikke hadde MSVR -virus. Oppsummert var deteksjonsdataene til CRISPR/CAS13A-MSRV Deteksjonssystem og det konvensjonelle RT-qPCR konsistente, noe som indikerer at CRISPR/CAS13A-MSRV Deteksjonssystem er gjennomførbart og kan erstatte de opprinnelige konvensjonelle og kompliserte deteksjonsmetodene til en viss grad.
Vertikal sammenligningskart over eksempler på qPCR -deteksjonsdata med qPCR og CRISPR
en. qPCR -deteksjon av MSRV klinisk prøveterskel syklusnummerdiagram; Det oppdagede prøvesyklusnummeret ble sammenlignet med det negative referansesyklusnummeret ved bruk av t-testeranalyse (** P<0.01);
b. CAS13A kombinert med MIRA -deteksjon av MSRV klinisk prøve fluorescensdiagram; Den oppdagede prøvefluorescensverdien ble sammenlignet med den negative referansefluorescensverdien ved bruk av t-tester-analyse (** p<0.01)
Oppsummert krever ikke CRISPR/CAS13A-MSRV Detection Method etablert i denne studien dyre eksperimentelle instrumenter, noe som gjør deteksjon på stedet raskt, nøyaktig og praktisk. Derfor, hvis denne deteksjonsmetoden brukes til å oppdage MSRV rettidig i selve avlsprosessen og ta målrettede og effektive tiltak, kan den derfor redusere tapene forårsaket av sykdommer i avlsprosessen. I tillegg er denne deteksjonsmetoden rask, svært følsom og spesifikk, og har gode anvendelses- og promoteringsmuligheter.