《Utvikling av en ny Cas13A/Cas12A-mediert"One-Pot" dobbelt Deteksjonsanalyse for genmodifiserte avling
Genmodifiserte avlinger har blitt mye plantet over hele verden, og mange land har gradvis forbedret sine regulatoriske tiltak for å sikre sikkerheten til genmodifiserte avlinger. Utviklingen av raske og nøyaktige genetiske deteksjonsmetoder på stedet er veldig viktig for landbruk og biosikkerhet, og kan lindre offentlige bekymringer for genmodifiserte produkter.
I denne studien utviklet forskningsgruppen en ny en-pott reaksjon -- Mira dobbeltdeteksjon kombinert med dual CRISPR (MR-DCA-metode) for samtidig deteksjon av CAMV35S og NOS-genetiske mål i genmodifiserte avlinger.
Eksperimentelle metoder
Mira dobbeltprodukt blir analysert av Cas13A og Cas12A dobbeltsystem for å generere to uavhengige signaler som ikke forstyrrer hverandre, og deretter blir lysstofffargen lest av et lysinstrument eller av en teststripe med to T-linjer for å oppnå dobbeltkanalsavlesning. Hele prosessen er fullført på mindre enn 35 minutter, med en deteksjonsgrense så lavt som 20 eksemplarer.
(Prinsippet for MR-DCA-deteksjon av CAMV35S og NOS)
Hele eksperimentet er delt inn i tre trinn: MIRA -amplifisering, CRISPR -reaksjon og to metoder for resultattolkning.
CAMV35S -genet brukes som mål for Cas13A, og NOS -genet brukes som mål for Cas12A. To par Mira -primere ble designet henholdsvis. Cas13A -systemet gjenkjenner bare RNA, så det fremre primerområdet er designet, som inneholder en T7 -promoter for påfølgende transkripsjon og aktivering av Cas13A. En PAM blir lagt til NOS -genet. Ovennevnte tillegg sikrer at både Cas13A og Cas12A-proteiner kan binde seg til sine respektive CRRNA-er, og det er ingen interferens eller kryssreaksjon mellom de to systemene.
Eksperimentell situasjon
Følsomhet og spesifisitet
Prøven ble fortynnet i en gradient for å teste fluorescensintensiteten til MIRA -reaksjonen. Det ble funnet at fluorescensintensiteten fremdeles kunne påvises ved en prøvekonsentrasjon på 20 ul. Konsentrasjonen på 20 ul ble endelig valgt for eksperimentet.
(Ulike prøvekonsentrasjoner og teststrimler brukes til fargeutvikling og intensitetskvantifiseringsberegning)
For å evaluere spesifisiteten til MR-DCA ytterligere, testet forskerteamet blandede prøver av ikke-transgene dyr og ikke-transgene planter. Resultatene viste at bare transgene prøver som inneholdt CAMV35S og NOS hadde høye fluorescenssignaler, mens fluorescensintensiteten til andre prøver var nær den negative kontrollen. MR-DCA kan brukes som en spesifikk dual-mål nukleinsyredeteksjonsplattform.
24 avlingsprøver ble testet av MR-DCA. Blant dem er 1, 2, 15, 16, 21 og 22 transgen mais som inneholder CAMV35S -promoter. 7, 8, 23 og 24 er sykdomsresistente transgen ris som inneholder NOS-terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 og 18 er transgene soyabønner som inneholder CAMV35S -promoter og NOS Terminator.
(Testresultater av 24 prøver)
Rask reaksjon
Reaksjonstid er en viktig faktor i deteksjon på stedet. Forskerteamet observerte at fluorescenssignalene til FAM og Hex kunne oppdages ved et fluorescensinstrument når reaksjonstiden var 10 minutter. Mira kombinert med CRISPR -reaksjon observerte også gul fluorescens etter 15 minutter.
(Fluorescenssignal ved forskjellige MIRA -reaksjonstider)
(Fargeutviklingen av teststrimlene ved forskjellige MiRA -reaksjonstider og intensitetskvantifiseringsberegningen)
Eksperimentell konklusjon
De eksperimentelle resultatene viste at den doble Mira har god spesifisitet og nøyaktig kan oppnå forsterkningsproduktene fra CAMV35S og NOS. Cas13A- og Cas12A -systemene reagerer uavhengig uten å forstyrre hverandre. MR-DCA-testen kan nøyaktig oppdage 20 kopier ved en lav temperatur på 35 minutter, noe som har stor verdi i å oppdage genmodifiserte avlinger i feltet.
Artikkelinformasjon
Journalnavn: 《Journal of Advanced Research Express
Artikkel Tittel: 《Utvikling av en ny CAS13A/CAS12A-mediert "One-Pot" Dual Detection Assay for Genetically Modified Crops Express
Effektfaktor: 11.4
Forskningsteam: Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences