Synlig og rask påvisning av felint chaphamaparvovirus ved bruk av multienzym isotermisk rask amplifikasjon og lateral flow-peilepinneanalyse
Tidsskrift:Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
Påvirkningsfaktor:4.6
Feline chaphamaparvovirus(FeChPV)er et nytt parvovirus, først oppdaget i diarékatter i Canada i 2019. Dets patogenisitet og molekylære egenskaper er fortsatt uklare, og det viser verts- og genetisk mangfold, noe som krever ytterligere epidemiologisk undersøkelse. Foreløpig er det ingen standardisert metode for FeChPV-deteksjon.
Multienzym isotermisk rask forsterkning-lateral flow-peilepinne (MIRA-LFD)-metodenhar blitt brukt med hell for å oppdage ulike virus, og tilbyr fordeler som hurtighet, enkelhet og ikke behov for presisjonsinstrumenter. Forskerteamet etablerte en MIRA-LFD-metode som er egnet for FeChPV for å møte utfordringer innen klinisk grasrotdeteksjon. Uten å stole på presisjonsinstrumenter,MIRA-LFD-metoden fullførte FeChPV-deteksjon ved 37 grader innen 20 minutter og viste ingen kryss-reaktivitet med andre virus. Deteksjonsgrensen var 32,3 kopier/μL,10 ganger høyere enn PCR-metoden. Videre oppdaget MIRA-LFD-metoden 29 FeChPV-positive prøver blant 417 katter med diaré, med en positivitetsrate litt høyere enn den nestede PCR-metoden. Disse resultatene indikerer at den etablerte MIRA-LFD-metoden for å oppdage FeChPV er en effektiv, økonomisk, pålitelig og enkel metode, som bidrar til tidlig forebygging og kontroll av FeChPV-infeksjon.
1. Eksperimentelle metoder
Kliniske prøver:Rektale vattpinneprøver som ble brukt i denne studien ble samlet inn fra 632 katter (inkludert 417 med diaré og 115 friske katter) og 474 hunder (inkludert 342 med diaré og 132 friske hunder) ved veterinærklinikker i Guangdong, Henan, Anhui-provinsen, i provinsen Innang, Moningolia, 2022 og 2024.
Nukleinsyreamplifikasjon:Ekstrahert DNA-nukleinsyre ble tilsatt til MIRA-systemet. Rekombinase og primere dannet et kompleks; ved hjelp av hjelpeproteiner og enkelt-bindende proteiner invaderte de den dobbelt-trådede DNA-malen. Primere bandt seg til homologe komplementære områder for å danne en D-sløyferegion, mens rekombinasen ble demontert fra komplekset. Polymerase bundet til 3'-enden av primerne og initierte DNA-syntese, eksponentielt amplifisert målregionen på malen. Denne prosessen gikk raskt og effektivt, og oppnådde dermed ultra-rask amplifisering av målfragmentet på bare 15 minutter.
Teststrimmelfargeutvikling:Nukleinsyreamplifikasjonsproduktet ble fortynnet 1:10, påført teststrimmelen, og resultatene ble lest etter 5 minutter.
Hele prosessen fra nukleinsyreamplifisering til teststrimmelfargeutvikling tok bare 20 minutter.
Amp-future biologiske produkter ble brukt i eksperimentet:
I studien ble fire utformede sett med spesifikke primer-probekombinasjoner screenet. Både agarosegelelektroforese og nukleinsyreteststrimler ble brukt for resultatpresentasjon. Alle fire primer-probekombinasjonene kunne oppdage FeChPV-viruset. I følge agarosegelelektroforeseresultatene viste FeChPV-4-kombinasjonen det lyseste målbåndet, så denne kombinasjonen ble valgt for påfølgende testing.
I henhold til agarosegelelektroforeseresultatene ga amplifikasjon i 5, 10, 15 og 20 minutter målbåndet. Målbåndintensiteten nådde en topp ved 15 minutters amplifikasjon, og etablerte 15 minutter som den optimale reaksjonstiden for denne analysen. Amplifikasjon ved 36 grader, 37 grader, 38 grader, 39 grader og 40 grader ga alle målbåndet, med det lyseste båndet observert ved 39 grader, og etablerte 39 grader som den optimale reaksjonstemperaturen for denne analysen.
(Figur A: 1: Amplifikasjon 5 min; 2: Amplifikasjon 10 min; 3: Amplifikasjon 15 min; 4: Amplifikasjon 20 min) (Figur B: 1: Amplifikasjon 36 grader ; 2: Amplifikasjon 37 grader ; 3: Amplifikasjon 38 grader ; 4: Amplifikasjon 38 grader ; 4: Amplifikasjon)
2. Deteksjonsytelse
Følsomhet:
(Figur A: MIRA-resultater presentert ved bruk av agarosegelelektroforese)
(Figur B: Nestede PCR-resultater presentert ved bruk av agarosegelelektroforese)
(Figur C: MIRA-resultater presentert ved bruk av nukleinsyreteststrimler)
Prøver ble utsatt for 10 ganger seriefortynninger fra 3,23×10⁶ kopier/μL. Nestet PCR med agarosegelelektroforese kunne stabilt oppdage 3,23×10² kopier/μL; MIRA med agarosegelelektroforese og MIRA med nukleinsyreteststrimler kunne begge stabilt oppdage 3,23×10¹ kopier/μL.
MIRA-metoden viste konsistent sensitivitet ved å bruke to forskjellige resultatpresentasjonsformater, og sensitiviteten til MIRA-metoden var overlegen den for nestet PCR.
Spesifisitet:
(1: FeChPV, felint chaphamaparvovirus; 2: FPV, felint panleukopeniavirus; 3: FeAstV, felint astrovirus; 4: FBoV, felint bocavirus; 5: CachaV, hundechaparvovirus; 6: negativ kontroll)
Den nyetablerte MIRA-LFD-metoden oppdaget bare FeChPV og viste ingen kryss-reaktivitet med andre referansevirus, noe som indikerer god spesifisitet.
3.Studiesammendrag
Denne studien etablerte en MIRA-LFD-metode for å oppdage FeChPV uten behov for høy-presisjonsinstrumenter. Som en effektiv, økonomisk og pålitelig deteksjonsmetode med høy sensitivitet og spesifisitet, er MIRA-LFD-metoden mer egnet for klinisk påvisning, og gir teknisk støtte for tidlig forebygging og kontroll av FeChPV-infeksjon.
4.AMP-FREMTIDIG BIOTEK
MIRA multienzyme isotermisk rask nukleinsyreamplifikasjon er en teknologi som virkelig muliggjør-rask deteksjon på stedet.
MIRA-teknologien er basert på in vivo-genrekombinasjonsreparasjonsmekanismen, og er avhengig av den synergistiske virkningen av flere funksjonelle proteiner ved romtemperatur for å oppnå rask (5-20 min), sensitiv, spesifikk og sikker nukleinsyreamplifikasjon ved romtemperatur (25 grader –45 grader). På grunn av den isotermiske naturen til MIRA-teknologien har den lave utstyrskrav og enkel betjening. Gjennom miniatyriserte bærbare enheter kan den brukes i frontlinjetesting på tvers av ulike applikasjonsscenarier, og bringe rask og nøyaktig nukleinsyretesting til innstillinger som POCT, hjemmetesting, landbruksområder og-lovhåndhevelse på stedet. Basert på MIRA-teknologi har Amp-future Biotech utviklet en serie med-hurtigtestingsprodukter på stedet, inkludert raske nukleinsyrefrigjøringsmidler, isotermiske raske nukleinsyreamplifikasjonsreagenser, kolloidalt gullteststrimler og miniatyrisert bærbart utstyr, og skaper en totalløsning for{11}}hurtig molekylær testing på stedet. Videre tilbyr Amp-futures MIRA-teknologi applikasjonsfordeler når den kombineres med CRISPR-teknologi, NGS, SNP, mikrofluidikk og mer.
I tillegg til serien med-hurtigtestingsprodukter vist ovenfor, tilbyr Amp-future Biotech også:
Forskningsreagenser:Gi reagensråmaterialer og teknisk støtte for grunnleggende vitenskapelig forskning, samt prosjektlitteraturreferanser.
OEM-produksjon:I stand til uavhengig å produsere ferdige produkter med høy-renhet og høy-aktivitet gjennom hele prosessen, og oppnå produksjon i industriell-skala.
Prosjektoppdragsutvikling:Sekvensinformasjon og sekvensjusteringsanalyseresultater, prosjektprimer-probedesign og -syntese, prosjektplasmidsyntese og prøver, prosjektrapporter og -resultater, etc.
For mer informasjon, velkommen til å spørre.